[摘要] MicroRNAs（miRNAs）是近年来发现的一种非编码的小RNA，长度仅22 个核苷酸左右，普遍介导基因转录后的调节，参与调控机体各种生理进程。miRNA与疾病如肿瘤的发生发展密切相关。研究发现血液循环中也存在miRNA，循环miRNA或可作为肿瘤无创诊断的新靶标。本文就miRNA的来源、功能、与疾病的关系、检测方法及其在肿瘤诊断和治疗中的应用等方面的研究进展作一综述。
[关键词] MicroRNA；检测；肿瘤；诊断；治疗
MicroRNA（miRNA）是一组由动物、植物和病毒基因组所编码的单链小RNA（～22 nt），它们不具有开放阅读框（ORF），不编码蛋白质，但却参与机体的各种重要的生理和病理过程，它们能够与靶mRNA 的3′-UTR（untranslated region）区的碱基互补配对而起作用，使其降解或抑制其表达，从而导致特定基因的沉默，对机体生长、发育及各种疾病尤其是肿瘤的发生和发展具有重要的调节功能[1]。近年来， miRNA已成为分子生物学、遗传学和临床医学等领域的研究热点，据推测人类约有三分之一基因编码的mRNA受到microRNA的负调控[2，3]。
1 MiRNA来源及其作用机制
MiRNA由基因组DNA编码，通过RNA聚合酶Ⅱ协助转录产生初始的miRNA——pri-miRNA，pri-miRNA 具有一个或多个茎环结构，在RNA 酶Ⅲ-Drosha 和Pasha/DGCR8 的切割下产生一个60～110 nt 的pre-miRNA，即miRNA 的前体。pre-miRNA通过输出因子exportin-5 转至胞浆，在RNA 酶Ⅲ-Dicer 的切割下产生约22 nt 的成熟miRNA。
MiRNA 结合至RISC 复合物上（RNA-inducedsilencing complex），与目标mRNA的3′-UTR区互补配对，导致翻译的抑制或mRNA 的降解[4]。当它与mRNA不完全互补配对时，会抑制翻译的过程；而当它与mRNA 完全互补配对时，则切割或降解mRNA[5]。其结果是导致相应蛋白质合成的缺失或者减少，导致疾病的发生。
2 MiRNA的发现、生物功能及其与疾病的关系
第一个被发现的miRNA lin-4，是1993 年Lee 在研究线虫（C.elegans）发育的时候发现的。他发现lin-4并不编码蛋白，能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3' 端的特定区域相互作用来抑制靶mRNA lin-14的表达，最终导致lin-14 蛋白质合成的减少，调控着线虫的发育。直到2000 年才发现了第二个miRNAlet-7，也是在线虫中发现的。研究发现它在线虫、果蝇和人类中高度保守区间，并且在表达上具有时空特异性。此后对miRNA的研究才逐渐增多起来。到如今，最新版本的miRNA 数据库（miRBase，http://www.mirbase.org/）收录的植物、动物和病毒的microRNA序列已经达到10867种，其中人类的占721种。
越来越多的研究证实，这种长度约22 nt 的小分子RNA在植物和动物中广泛存在，具有很广泛的调控作用，是高等植物、动物生长发育的重要调节因子。植物miRNA 最先于2002 年由Reinhart 等[6]从拟南芥小分子文库中获得。植物miRNA 的功能是调控植物形态建成、调控植物环境适应性及调控植物发育进程。对动物机体中miRNA的研究更是数不胜数。一系列的研究表明，miRNAs 在胚胎干细胞和多种成体干细胞的发育、胚胎后期发育、细胞生长和凋亡、血细胞分化、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏发生及免疫系统的调控等过程中发挥着重要作用。
MiRNA 与人类肿瘤的关系更成为研究的热点。大部分的miRNAs 在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragile site），说明miRNAs在肿瘤发生过程中起着至关重要的作用。越来越多的研究表明，miRNA参与了包括神经母细胞瘤、垂体腺瘤、甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌及白血病等在内的多种肿瘤的发生、发展过程。这些肿瘤组织中存在不同miRNA 表达量的上调或者下调，类似于抑癌基因和癌基因的功能。由于不同肿瘤组织中存在特定的miRNA 的表达谱，这就极易令人联想到它在肿瘤的诊断及治疗方面的潜在作用。
据证实miRNA与人类病毒感染性疾病也有关。EB病毒感染过的B 细胞被观察到miR-155 表达增高。Lecellier等[7，8]研究表明内源性miRNA也可介导抗病毒防御，如miR-32是由宿主产生的内源性miRNA，可阻断逆转录酶病毒PFV-1（primary foamy type 1）在人体细胞内的积累。此外miRNA还被发现参与心血管疾病、神经系统疾病、自体免疫病、内分泌代谢病、皮肤病、眼部疾病、高血压病及淋巴增殖性疾病等。
3 MiRNA表达的检测方法
要了解miRNA 在机体中时间、空间的表达情况及其在机体生理、病理过程中所起的作用，必须有合适的方法对其进行检测和分析。对于新发现的miRNA，一般采用克隆测序的方法。而对于已知的miRNA，现阶段主要有基于核苷酸杂交基础上的方法和基于PCR基础上的miRNA检测方法。基于核苷酸杂交基础上的方法有RNA印迹技术（Northern blot）、原位杂交技术、微阵列技术和基于微球的流式细胞术等4 种。RNA印迹技术是检测RNA的经典方法，常用来评价其他miRNA 检测方法的可靠性。但成熟miRNA 分子片段太短且含量较低，用传统的Northern blot 方法检测敏感性相对较低，且要求的标本量相对较大，不适用于临床样本的高通量检测。有报道用锁定核酸（locked nucleic acid，LNA）探针代替传统的DNA寡核苷酸探针，提高了检测miRNA的敏感性和特异性[9]。原位杂交技术的优点是能够显示miRNA表达的位置，甚至达到细胞定位的水平，尤其适用于石蜡包埋或福尔马林固定后的标本。微阵列技术（microarray）也称生物芯片、DNA芯片或者基因芯片技术，它的特点是高通量，可以一次分析人的整个基因组，在10 分钟内定量获得3 万多个基因的表达[10]。但是该方法的重现性和准确性相对比较差，一般多用于初筛。基于微球的流式细胞术（bead-basedflow-cytometry）即液相芯片技术将流式细胞检测与芯片技术有机地结合在一起，通量大、检测速度较快、灵敏度高、特异性好，但是必须防止可能的交叉污染。
基于PCR基础上的miRNA检测方法主要有茎环引物逆转录聚合酶链反应（stem-loop RT-PCR）法[11]和RNA加尾和引物延伸RT-PCR 法[12]等。MiRNA 仅为22 nt左右，只相当于一个引物的长度，不能直接用PCR进行检测。上述的这两种方法都意在增加miRNA的长度使其适于检测，目前都已有相应的试剂盒问世。此外还有小靶点定量聚合酶链反应[13]，Kato 建立的运用DNA探针检测的方法[14]及Drikell 等建立的表明增强拉曼光谱法（SERS）[15]等。相信随着技术的不断进步，将会有更多更先进的检测方法问世，为miRNA 的深入研究并应用于临床检测和治疗创造条件。
4 MiRNA与肿瘤的诊断
早期诊断和早期治疗是决定肿瘤患者治愈率及预后的一个重要因素，临床中最常用的检查方法是影像学及血清标志物检验，但这些方法往往只能在肿瘤发展到一定的程度后才能检测出来。研究发现miRNA可能成为肿瘤早期诊断的生物新靶标。据报道细胞中一种特殊的miRNA 分子——miR-155 水平的升高能够诊断一些人类癌症，尤其是淋巴瘤。
miR-155 水平的升高可能有助于医生区别不同类型的淋巴瘤[16]。因此，这一发现可能在癌症的诊断方法中大有用处。Yanaihara 等[17]用基因芯片技术分析了肺癌的miRNA 表达谱，发现在104 种肺癌miRNA 中有43 种与相应的正常组织有显著差异，其中8 个miRNA和肺癌患者的预后密切相关，如高表达的miR-155 和低表达的let-7a-2 提示预后较差。通过miRNA 表达谱甚至还可以鉴定肿瘤的组织学类型[18]。不同肿瘤具有不同的miRNA表达模式，通过miRNA表达谱的分析，将有助于临床上对肿瘤进行诊断、分期及预后的估计，因此有人预测miRNA 将成为肿瘤早期诊断及预后评估的新靶标。
近来人们研究发现血液循环中存在miRNA，第一个被发现的血清miRNA标志物是miR-21。有研究表明，弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的血清中miR-21 水平很高，后者与增高的不复发存活率密切相关[19]。
MiRNA 在血清中非常稳定，不能被血液中降解其他RNA分子的酶降解，甚至可以在室温放置24 小时之后反复冻融8 次而保持数量稳定；肿瘤的miRNA能够进入血液循环，血液中的miRNA 量可以在一定程度上反映肿瘤的大小，循环miRNA 可以作为癌症检查的生物新靶标[20]。Gilad 等[21] 的研究还表明血清miRNA能够反映机体特定的生理变化。Chen 等[22]研究证实，在人类及小鼠、大鼠、胎牛和小牛等一些动物血清和血浆中均存在miRNA，而且在同一种类动物及人类的不同个体中，血清miRNA 的表达稳定一致。肿瘤miRNA在血液中的存在可能是肿瘤死亡和溶解、或者由肿瘤细胞释放出miRNA 到其周围微环境的结果。Kimberly E.Resnick 等[23]用微阵列的方法检测28 例卵巢上皮癌患者和15 例正常对照者血清中的miRNA，从检出的miRNA中间选出21 种做进一步的PCR 检测，发现癌症患者有5 种miRNA 高于正常对照者，3 种低于正常对照者。Chen 等[22]用单分子微阵列技术（Solexa 技术） 对健康中国人的血清所有miRNA 进行测序，分别在男性和女性中发现了超过100 种和91 种血清miRNA。肺癌、结直肠癌和糖尿病患者均存在疾病特异性血清miRNA表达谱。在肺癌患者的血清中有63 种miRNA是健康人血清中所不存在的，而有28 种健康人血清中的miRNA却没有被检出。此外，在75 名健康志愿者和152 例非小细胞肺癌患者中进行的独立验证研究中，研究者还证实了2 种非小细胞肺癌特异性的miRNA。血液中存在miRNA，且不同的miRNA 表达谱可以反应机体不同的生理或者病理状态，因而对血液中的miRNA 进行检测和分析或可作为一种无创疾病诊断的新手段。
5 MiRNA在疾病治疗中的潜能
既然肿瘤组织中存在特异miRNA表达量的上调或下调，就可以利用抑制致癌性miRNA 和补充抑癌性miRNA的方法使两者的量达到平衡从而达到肿瘤基因治疗的目的。反义寡核苷酸是指能通过碱基互补原则与目标靶RNA或DNA特异性互补的短链核苷酸片段，临床上可利用反义寡核苷酸转染癌细胞，从而使过量表达的癌性miRNA得到抑制。对小鼠静脉注射与miR-16、miR-122、miR-192和miR-194互补的反义寡聚核苷酸后，可在多个器官观察到相应miRNA的大量减少[24]。在小鼠心衰模型的心脏成纤维细胞中存在miR-21的上调，当利用一个特定的反义寡核苷酸使miR-21 沉默时，心脏衰竭可以防止或可使组织损伤得到一定逆转[25]。这项研究说明了miR-21 是心脏衰竭的一个治疗靶标，并且说明miRNA具有广泛的治疗潜力。此外，恢复癌细胞中表达下调，但在正常细胞中高表达的miRNA可能是另一个安全有效的肿瘤治疗途径。Kota等[26]在一项实验中将在肝癌细胞中低表达但在正常组织中高表达的miR-26a通过病毒转到肝癌小鼠的体内，发现肿瘤细胞发生增殖抑制或者凋亡。这项研究为肝癌治疗提供了新的思路，为将抑癌miRNA在全身给药作为一种抗癌途径提供了理论依据。
总之，miRNA 通过转录后调节的机制广泛影响着机体的各种生理和病理进程，越来越多的研究揭示出其在疾病的发生及发展中所处的重要地位，它在疾病诊断、治疗及预后提示方面的作用也被有关研究所证实。血液循环中存在与机体疾病相关的miRNA，并且能耐受RNA酶的破坏而稳定地存在于血液循环中。相信随着对miRNA与疾病关系研究的深入及检测方法的标准化，循环miRNA 的检测将成为疾病无创诊断、治疗和预后的新手段。
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